GC-MS法測(cè)定動(dòng)物食品中的三聚氰胺

Spectra-Quad實(shí)現(xiàn)三聚氰胺含量在線檢測(cè)

超液相色譜_電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中殘留的三聚氰胺

反相液相色譜法測(cè)定飼料中三聚氰胺的含量

液相色譜-二極管陣列法測(cè)定高蛋白食品中的三聚氰胺

液相色譜法(HPLC)測(cè)定飼料中三聚氰胺的含量

液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定飼料中三聚氰胺含量

固相萃取與液相色譜聯(lián)用測(cè)定寵物食品中三聚氰胺

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMS)分析寵物食品中三聚氰胺

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中三聚氰胺殘留

GC-MS法測(cè)定動(dòng)物食品中的三聚氰胺

測(cè)定方法

  本實(shí)驗(yàn)中綜合各方法穩(wěn)定性進(jìn)行比較，主要介紹以下三種：

• 固相萃取（SPE）方法
•  HPLC-UV檢測(cè)方法
•  LC-MS檢測(cè)方法（僅供參考）

檢測(cè)中所需的儀器與條件

•    Agilent1100液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫：40℃。

(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm)；緩沖液：10mM檸檬酸,10mM庚烷磺酸鈉;流動(dòng)相：緩沖溶液：乙腈=85：15；流速：1.0mL/min。

(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm)；流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15；緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0;流速：1.0mL/min； 

•   離子交換固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰爾科技有限公司)

        混合型的陽離子交換柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50支

•    臺(tái)式高速（微量）離心機(jī) TG16-WS/TG16-W (湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)

（1）角轉(zhuǎn)子: 12＊1.5ml；12＊10ml  轉(zhuǎn)速≥8000rpm/min，微機(jī)控制可定時(shí)；常溫

（2）離心管：10ml.或1.5ml（一套） 

•  三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品1瓶(250mg,≥99.5％) 

•    三聚氰胺分析方法手冊(cè)１份

其他試劑

飼料/奶粉樣品；甲醇、乙腈；氨水、乙酸鉛、三氯乙酸、檸檬酸、庚烷磺酸鈉 、辛烷磺酸鈉(Sigma公司)；甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。

理化性質(zhì) 

三聚氰胺:英文名"melamine",簡(jiǎn)稱三胺,學(xué)名三氨三嗪,別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3:分子量:126.12

物理性能:白色結(jié)晶粉末,無毒,無味;相對(duì)密度:1570kg/m³;熔點(diǎn):在常壓下,354℃分解;升華溫度：300℃;溶解性:能溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳、苯和四氯化碳，水溶液呈弱堿性

化學(xué)性能：三聚氰胺是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，顯弱堿性，能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚酸二酰胺鹽；在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解，胺基逐步被羥基取代，處成三聚氰酸二酰胺、三聚握酸一酰胺和三聚氰酸；三聚握胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物；三聚氰胺與甲醛反應(yīng)制成樹脂，三聚氰胺樹脂，三聚氰樹脂是一種多種用途的材料，防水耐熱且有很高的穩(wěn)定性，用于生產(chǎn)塑料、地板磚，廚房用具，防炎纖維，商業(yè)濾膜，膠水和阻燃劑。

 固相萃取（SPE）方法

1 固相萃取（SPE）柱的選擇： 

三聚氰胺呈弱堿性（弱陽離子化合物），凈化過程一般選擇陽離子交換柱。混合型的陽離子交換柱（PCX）通過將磺酸基因（-SO₃H）鍵何在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附劑上，具有陽離子和反相兩種吸附機(jī)理，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)               可通過兩種不同溶液的洗滌（水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑），使樣品更干凈，提高檢測(cè)的靈敏度。

2)               批次重復(fù)性好。

3)               回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。

圖  PCX結(jié)構(gòu)式

2 樣品前處理步驟：

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制：

     取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以20%甲醇溶解定容至50ml得到1000ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)，以提取液（1%三氯乙酸）稀釋至所要的濃度。

2.2 提取

     稱取飼料/奶粉樣品5g （或牛奶10ml），加入50ml  1%三氯乙酸提取液，充分混勻，加入2ml 2%乙酸溶液，超聲20min。然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，并將其放置于離心機(jī)中，啟動(dòng)離心機(jī)使轉(zhuǎn)速達(dá)到8000rpm/min 離心 10min后，取上清液3mL 過混合型陽離子交換小柱（PCX）。 

2.3 凈化（PCX小柱，60ml/3ml）：

   1） 活化及平衡： 3ml甲醇 ，3ml 水

   2） 上樣：加入提取液 3ml

   3） 淋洗：3ml 水；3ml甲醇：棄去淋洗液并將小柱抽干。

   4） 洗脫：5ml  5%氨化甲醇（v/v）洗脫。（5%氨化甲醇的配制：5ml氨水+95ml甲醇）。

  5)  濃縮：50°C,氧氣吹干，20%甲醇/水定容至2ml。HPLC分析或衍生后GC/MS分析。

HPLC-UV檢測(cè)方法

三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，需要用離子對(duì)試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的三聚氰胺檢測(cè)方法和中國(guó)農(nóng)業(yè)部頒部的三聚氰胺檢測(cè)方法，采用Venusi ASB系列親水色譜柱，均能得到良好的結(jié)果，分析色譜圖如下： 

1、 三聚氰胺的FDA檢測(cè)方法

色譜柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm

緩沖液：10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)Ph為3.0

流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15

進(jìn)樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL,進(jìn)10uL

流  速：1.0Ml/min

柱  溫：40 °C

波  長(zhǎng)：240nm

2、三聚氰胺的中國(guó)農(nóng)業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法

色譜柱：Venusil ASB-C8 4.6×250mm

緩沖液：10mM檸檬酸，10mM庚烷磺酸鈉

流動(dòng)相：緩沖溶液：乙腈=85：15

進(jìn)樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL,進(jìn)10uL

流  速：1.0Ml/min

柱  溫：40°C

波  長(zhǎng)：240nm

表1 PCX柱回收率

由上表1可以看出：用PCX柱凈化樣品，可以得到滿意的回收率，此方法處理樣品，比FDA公布的前處理方法更加準(zhǔn)確、可靠。

LC-MS參考方法   LC-MS方法檢測(cè)三聚氰胺的譜圖 

      由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流動(dòng)相添加了離子對(duì)試劑，限制了液質(zhì)聯(lián)用方法的使用；但不用離子對(duì)試劑色譜方法，三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，沒有良好的保留與分離。 源于此問題采用Venusil ASB系列親水色譜柱，不用離子對(duì)試劑也能得到有效的保留與分離，參考方法如下：

    緩沖液：10mM NH4AC

流動(dòng)相：緩沖液：ACN=95： 5

進(jìn)樣量：先用70%ACN溶解成約1mg/mL,用CAN稀釋成1.0mg/mL,進(jìn)10uL

 柱  溫：40°C

波  長(zhǎng)：240nm 

與FDA2007年4月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比較，該方法大大降低了zui低檢測(cè)限(MSD：0.5ppm；UV：2ppm)，提高了檢測(cè)靈敏度。

       以該方法分別在ASB-C84.6×250mmASB-C184.6×250mm得到的譜圖如下：

結(jié)果與討論

陽離子交換柱(PCX)

    三聚氰胺呈弱堿性(弱陽離子化合物)，凈化過程一般應(yīng)選擇陽離子交換柱。混合型的陽離子交換柱(PCX)通過將磺酸基團(tuán)(-SO3H)鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機(jī)理，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：

a)可通過兩種不同溶液的洗滌(水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑)，使樣品更干凈，提高檢測(cè)的靈敏度。

b)批次重復(fù)性好。

c)回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。

      國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心有關(guān)人士稱，在現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)奶粉檢測(cè)中，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂肪、細(xì)菌等檢測(cè)。三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，所以現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)包含相應(yīng)內(nèi)容。也就是說，三聚氰胺不屬于常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，正常情況下，很少有人會(huì)想到去檢測(cè)它。